所謂Real-Time PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。real-time PCR技術(shù)即實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差,提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗(yàn)證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
Real-Time PCR操作流程
Real-Time PCR操作流程 - 根據(jù)已知全長基因序列及待檢基因的背景信息,設(shè)計(jì)并合成Realtime PCR引物
- RNA抽提:提供組織、細(xì)胞等來源樣本的RNA抽提服務(wù),并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
- 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中,進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測
- 檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析
- 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告:包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表。